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cKI小鼠模型構(gòu)建
更新時(shí)間：2025-06-26
訪(fǎng)問(wèn)量：45
廠(chǎng)商性質(zhì)：其他
1. cKI小鼠模型構(gòu)建策略選擇
A. 核心元件設(shè)計(jì)
目標(biāo)基因（GOI, Gene of Interest）
將外源基因（如報(bào)告基因、突變基因或熒光蛋白）插入內(nèi)源基因位點(diǎn)，或替換特定外顯子。
條件性調(diào)控系統(tǒng)
Cre-loxP系統(tǒng)：通過(guò)組織特異性Cre重組酶實(shí)現(xiàn)條件性激活。
FLEx（Flip-Excision）系統(tǒng)：結(jié)合Flp-FRT和Cre-loxP實(shí)現(xiàn)多重調(diào)控。
誘導(dǎo)型系統(tǒng)（如Tet-on/off、他莫xi芬誘導(dǎo)的Cre-ERT2）。
B. 心臟特異性cKI常用工具
啟動(dòng)子：αMHC（Myh6）、cT*T（Tnnt2）驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)。
報(bào)告基因：如tdTomato（loxP-stop-loxP-tdTomato）用于追蹤表達(dá)。
2. cKI小鼠模型構(gòu)建技術(shù)流程
A. 載體設(shè)計(jì)
靶位點(diǎn)選擇
安全港位點(diǎn)（如Rosa26、H11）或內(nèi)源基因位點(diǎn)（需同源重組）。
避免干擾鄰近基因（需UCSC基因組瀏覽器分析）。
條件性敲入結(jié)構(gòu)（以Rosa26-loxP-STOP-loxP-GOI為例）：
5'同源臂 + loxP-STOP-loxP + GOI + 3'同源臂 + 篩選標(biāo)記（如Neo）。
B. 基因編輯方法
CRISPR-Cas9介導(dǎo)的KI
設(shè)計(jì)sgRNA靶向插入位點(diǎn)，與供體載體共注射至受精卵。
供體載體：包含同源臂和條件性表達(dá)盒（如圖1）。
ES細(xì)胞打靶（傳統(tǒng)方法）
電轉(zhuǎn)ES細(xì)胞后篩選陽(yáng)性克隆，顯微注射至囊胚。
C. 小鼠品系建立
Founder小鼠鑒定
PCR或Southern blot驗(yàn)證正確整合。
與Cre品系交配
例如：Rosa26-lsl-GOI × αMHC-Cre → 心臟特異性GOI表達(dá)。
3. 驗(yàn)證與表型分析
A. 基因型驗(yàn)證
PCR：檢測(cè)loxP位點(diǎn)、GOI插入及Cre重組效率。
測(cè)序：確認(rèn)無(wú)脫靶突變。
B. 表達(dá)驗(yàn)證
qRT-PCR/Western blot：檢測(cè)GOI在心臟中的表達(dá)水平。
免疫熒光/組織染色：定位GOI表達(dá)（如tdTomato熒光）。
C. 功能表型
心臟功能：超聲心動(dòng)圖（EF%、FS%）、心電圖（心律失常）。
病理分析：心肌纖維化（Masson）、 hypertrophy（WGA染色）。
4. 常見(jiàn)問(wèn)題與優(yōu)化
A. 低重組效率
解決：優(yōu)化Cre品系（如高表達(dá)αMHC-Cre）或使用誘導(dǎo)型Cre（他mo昔芬）。
B. 背景泄漏表達(dá)
優(yōu)化：加強(qiáng)STOP序列（如三重polyA信號(hào)）或選擇更嚴(yán)格的啟動(dòng)子。
C. 脫靶效應(yīng)
解決：全基因組測(cè)序（WGS）篩選Founder小鼠。
5. 應(yīng)用示例
案例1：心臟特異性表達(dá)熒光報(bào)告基因
構(gòu)建：Rosa26-lsl-tdTomato × αMHC-Cre → 心肌細(xì)胞紅色熒光標(biāo)記。
用途：追蹤心肌細(xì)胞譜系或移植細(xì)胞命運(yùn)。
案例2：條件性激活突變基因
構(gòu)建：Knock-in loxP-STOP-loxP-mutant-Kras × cT*T-Cre → 心肌特異性致癌突變模型。
6. 注意事項(xiàng)
對(duì)照設(shè)計(jì)：
必須包括：無(wú)Cre的GOI小鼠（loxP-STOP-loxP-GOI）、Cre單獨(dú)表達(dá)小鼠。
時(shí)間控制：
誘導(dǎo)型Cre（如Cre-ERT2）需優(yōu)化他mi昔芬劑量和時(shí)間窗口。
倫理與標(biāo)準(zhǔn)化：
遵循ARRIVE指南，確保動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。
